【脑胶质瘤文献】人参皂苷Rh2抑制人脑胶质瘤细胞SHG44生长及机制研究-竹林七贤
人参皂苷Rh2抑制人脑胶质瘤细胞SHG44生长及机制研究
神经胶质瘤是来源于神经外胚层的颅内常见恶性肿瘤，复发率高，生存期短。开展神经胶质瘤综合治疗，加强基础研究是神经外科学等多学科的重大课题。本实验发现人参皂苷Rh2(简称Rh2)能显著抑制人脑胶质瘤细胞SHG44(简称SHG44)的生长。实验结果为Rh2作为新药应用提供了有价值的资料。
一、材料与方法
1. 材料：Rh2(本院陈燕萍教授惠赠)常林钻石 ，SHG44购于上海细胞研究所。细胞增殖核抗原 (PCNA)-SABC 免疫试剂盒(武汉博士德公司)。PCNA-DNA引物设计如下：PCNA上游引物，CYGCAGAGCATGGACTCGTC ，下游引物CCGTTGAAGAGAGTGGAGTG，β-actin上游引物, AAGAGAGGCATCCTCACCCT，下游引物，TACATGGCTGGGGTGTTGAA . 顺序为5-3’。
2. 方法：
（1）细胞生长曲线：SHG44常规培养对数生长期细胞成1.25*105密度，接种于24孔板、24h后更换培养液，分别加入浓度为0、4、8、16、32μmol/L的Rh2，此日为第0天。分别于第1、2、3、4、5天，每组消化3复孔细胞，单竞缇台盼蓝染色判定细胞活性后，光镜下计数。第三天更换培养液，并维持Rh2浓度。
（2）MTT实验：消化对数生长期的SHG44，支撑2*105细胞/ml细胞悬液，工业设计师简历接种于96孔平板，没空2*104细胞悬液100μl，同时分别加入上述终浓度100μlRh2。培养72h，采用MTT法检测各组细胞的抑制率五颜六色造句 。试验中发现16μmol/L的Rh2效果最好，在电镜和流式细胞仪及PCNA的组织化学和PCNA的RT-PCR转录研究中主要采用16μ mol/L及一下浓度。
（3）流式细胞检测细胞凋亡及细胞周期变化：消化SHG44漩涡慕留人，以5*105接种25cm2培养瓶，24h后更换培养液，分别加入终浓度为0、8、16μmol/L的Rh2，此日被称为第0天。在第3天分别收集各组细胞，检测各组的凋亡率和细胞周期变化。
(4)电镜检测：细胞传代培养，分别加入Rh2终浓度为0、8、16μmol/L。3d后更换一次培养液(含Rh2)，培养5d，导致镜拍片后，消化并收集细胞，用Epon812包埋，切片，随机拍摄电镜照片，观察超微结构。
（5）免疫组织化学方法（ABC法）检测PCNA蛋白表达情况：12孔板内，实验组加入细胞悬液100μl，16μmol/L Rh2 200μl，DMEM1.7ml，对照组加入无Rh2的对照液200μl，培养3d，常规免疫组话，ABC法染色。结果判定，光镜检查扔蛇门 ，PCNA蛋白阳性表达为细胞核呈棕黄色，用目镜网格测微尺人选10个视野(4*)，每视野观察100个细胞，记阳性细胞数，结果以平均值±标准差表示，t检验。
(6)聚合酶链反应监测PCNA转录产物含量：接种SHG44细胞5*105/25cm2培养瓶分别加入Rh2，终浓度为8和16μmol/L。第三天用Tripue等时机提取总RNA，精确定量。PCR反应管加入1μloligodT1μl总RNA液体金寨天气预报，置于PCR仪中鲍伯·纽哈特，80℃10min，冰水浴5min，没管中加入1μl RNA酶抑制剂，2μl dNTP，1μl逆转录酶，4μl 5*buffer，补水至20μl。置于PCR仪中42℃反应2h；95℃加热5min，-20℃保存备用。PCR反应体系：①10*buffer 5μl；②dNTP2μl；③PCNA上游及下游引物各2μl；④β-action上游及下游引物各2μl；⑤cDNA模板1μl；⑥TagE(热稳定性DNA聚合酶)，补水至50μl。PCR 程序：95℃35秒，60℃1min成谋商城 ，72℃1min，30个循环。结果检测：取20μlPCR反应物，1.5%琼脂糖凝胶电泳；Kodak凝胶电泳成像分析系统(EDAS)分析，计算对照组与实验组PCNA/β-action的比值。
二、结果
1. 细胞增殖的变化：Rh2对SHG44有生长抑制作用，并呈现浓度时间依赖性。8、16、32μmol/L Rh2作用3d后细胞增殖受抑制，P<0.05；作用5d后，P<0.01。以上实验组与对照组细胞存活比率>90%.
2. MTT检测结果：4-32μmol/L的Rh2均有抑制作用，32μmol/L时细胞抑制率接近90%。
3. 流式细胞仪检测结果：Rh2可以诱导SHG44凋亡异界大巫，于G0/G1可见凋亡峰申春玲，Rh2 8、16μmol/L组凋亡比率有明显提高。给药组细胞碎片明显提高。
4. 细胞超微结构改变：2个剂量组Rh2作用5d后，电镜下可见细胞呈现凋亡形态学改变，胞体变小，变圆；核内染色质离散，想核膜下集中；细胞表面微绒毛辨析，细胞体及细胞核进一步缩小无量道尊 ，核内染色质呈颗粒状或块状凝集于核膜下，内质网和线粒体膜碎裂呈空泡状；微绒毛脱落，减少，核膜在核膜孔处断裂，将染色质分割成若干个核碎片；胞质内空泡增多水草舞。对照组细胞体积大胞质少，核内染色质分布均匀；细胞表面有大量的微绒毛搜同1069。
5. PCNA蛋白表达情况：Rh2 16 μmol/L给药5d后PCNA-LI(PCNA-标记指数)(22±5.21)明显低于对照组（55±7.68）。
6. PCNA转录产物含量的变化：PCNA基因与β-catin的RT-PCR产物长度分别为558bp和211bp。对照组和2个给药组的PCNA/β-actin密度平均比值分别为1.2、0.8和0.9.
三、讨论
Rh2是红参中发现的皂苷类物质。分子式为C36O8H62，分子量622.88，学名22(S)-Proto-panaxadiol-3-O-Β-d-glucopyanoside,分子量小，脂溶性强，已通过血脑屏障。Rh2能通过逆转耐药等多种途径抗肿瘤。SHG44是人脑胶质瘤细胞，比啮齿类胶质瘤细胞株更接近临床，因此研究价值更高。
实验表明浓度为4μmol/L的Rh2能够抑制SHG44的增值，32μmol/L几乎使SHG44增值停止，抑制率达90%。研究表明，诱导分化剂作用机制是减少进入细胞分裂周期的细胞数，并使细胞阻滞于某一时相，不能完成DNA复制刘墨林 ，同时细胞凋亡率明显增高。细胞一旦通过G-S限制点(restriction point)，便不再受其他因素的调控而进入S期完成DNA的复制，所以作用于G-S限制点的药物可以组织细胞进入分裂周期。本实验充分证明Rh2对SHG44有诱导凋亡作用：显著降低G2–M期和S期细胞的比例，呈现G1期细胞阻滞，给药组的凋亡率较对照组有统计学意义。大量细胞阻滞于G0-G1期，增殖受限。
增殖细胞核抗原(PNCA)是一种仅在增殖细胞中合成与表达的36KD的酸性蛋白，人类PCNA基因全长约7.0kb，位于第20号染色体。细胞内PCNA含量反映了细胞增殖周期有关，G1期表达逐渐增加，S期达到高峰G2/M期减少。PCNA是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，为DNA复制合成必不可少的因子。本实验既检测PCNA的蛋白表达水平明火珠之影 。Rh2处理后5d的SHG44中PCNA蛋白的表达与转录产物较对照组有明显下降。通过RT-PCR法检测PCNA的蛋白表达水平也检测了转录产物表达水平。Rh2处理后5d的SHG44中PCNA蛋白的表达与转录产物较对照组有明显下降。通过RT-PCR法检测PCNA的转录产物情况，在药物对肿瘤细胞抑制机制研究文献中还未见报道。Rh2是小分子脂溶性物质，可能很容易通过肿瘤细胞的质膜进入细胞核，通过某种机制抑制了PCNA基因的转录或减少了转录产物。Rh2不尽在体外有抑制SHG44增殖作用，体内也能抑制大鼠闹内移植的SHG44增殖作用优丽欧壁纸，体内也能抑制大鼠脑内移植的SHG44实体瘤的生长。
综上所述五营吧，Rh2抑制SHG44细胞增殖机制与抑制SHG44的PCNA基因蛋白表达，减少基因转录产物，诱导细胞凋亡有关。Rh2可能成为治疗胶质瘤的新药。
参考文献
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